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UNIVERSIDAD DE VALENCIA
FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA

FUNDAMENTOS Y FUNCIONES DE LA ESPECTROMETRIA
DE MASAS

ANDROS CORRAL PAYÁ
VALENCIA, MAYO 2006

“ A todos aquellos que me abrieron
los ojos para que pudiera
encontrar mi camino”

"Il faut faire de la vie un rêve et faire d'un rêve une réalité"
Pierre Curie

“Agradecer a Andrea, por tener siempre
tanta paciencia y ayudarme a mantenerme cuerdo
durante estos cinco años”

ABSTRACT

En la actualidad, la ciencia avanza a pasos agigantados, y cada vez resulta más complicado asimilar todos los conceptos nuevos a los que tenemos que hacer frente en el quehacer científico. Dentro de este mundo, las técnicas espectroscópicas siempre han sido piezas fundamentales, y resulta necesario entenderlas a la perfección. En este artículo se discutirá sobre los fundamentos de una técnica como la espectroscopia de masas, tanto teóricos como técnicos, explicando todos los cambios que se han sucedido a lo largo de su corta pero intensa historia. Resulta fundamental estudiar cuales son sus posibles aplicaciones en el mundo científico actual y realizar una reflexión sobre las ventajas e inconvenientes de esta técnica frente a otras, analizando su utilidad real hoy en día.

PALABRAS CLAVE

Métodos analíticos, técnicas espectroscópicas, espectrometría de masas, espectrograma, estructura molecular, J. J. Thomson., E.M..

INTRODUCCIÓN

La Espectrometría de Masas es una poderosa técnica microanalítica usada para identificar compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y propiedades químicas de moléculas. La detección de compuestos puede ser llevada a cabo con cantidades realmente pequeñas (algunos pmoles) de muestra y obtener información característica como el peso y algunas veces la estructura del analito.
En todos los casos, alguna forma de energía es transferida a las moléculas a analizar para afectar la ionización. En la técnica clásica de impacto electrónico (electron ionization EI), algunas de las moléculas ionizadas del analito “explotan” en una variedad de fragmentos ionizados, el patrón de fragmentación resultante así como los
iones residuales constituyen el espectro de masas. En principio, el espectro de masas de cada compuesto es único y puede ser usado como se “huella química” para caracterizar el analito.

LOS INICIOS DE LA ESPECTROSCOPIA DE MASAS

Corría el año 1912 cuando el científico J. J. Thomson (Premio Nobel en 1906) empujado por su afán de descubrir los secretos más profundos de la química, se las ingenió para crear el primer espectrómetro de masa y obtener de él los primeros espectros de elementos como O2, N2, CO y COCl2.

Pero el mérito no fue solo de él, ya que la espectrometría de masas comenzó a ver la luz en el año 1886 cuando Goldstein descubrió los iones positivos, siguió cogiendo forma con W. Wien que consiguó analizarlos por deflección magnética en 1898 y que dio un paso definitivo cuando W. Kaufmam consguió analizar los rayos catódicos usando campos eléctricos y magnéticos paralelos en 1901. Todos estos avances permitieron a la

privilegiada mente de J. J. Thomson idear el primer espectrómetro de masas (Skoog, Hiller, Nieman, 2000, 182).
A partir de ese día se comenzó a usar en los laboratorios de química para separar iones atómicos y moleculares en función del cociente masa/carga con la unidad Thomson (Th) como unidad fundamental. Y aunque su avance era firme, su uso para analizar macromoléculas no fue posible hasta la década de los 80, cuando el profesor J. B. Fenn utilizó el método de ionización por electropulverización ("electrospray") de una solución acuosa de proteínas. De esta forma consiguió producir pequeñas gotas de una muestra que se reducen de tamaño al evaporarse el agua que las transporta, mientras los iones de proteínas permanecen en forma de suspensión libre. La relación masa/carga de los iones así obtenidos permite su análisis en cualquier espectrómetro de masas. Biólogos y químicos pueden ahora rápidamente identificar las proteínas y obtener su imagen tridimensional (Rubinson, Rubinson, 2000, pg. 289).
La espectrometría de masas atómicas es una herramienta muy versátil y util para identificar los elementos presentes en una muestra y determinar las concentraciones de cada una de las materias que la componen. Esta técnica nos permite determinar prácticamente todos los elementos del sistema periódico.

Esta técnica ofrece numerosas ventajas frente a las técnicas espectofotométricas ya que:

En cambio, también tienen una serie de desventajas que no podemos obviar como:

Con la espectrometría de masas somos capaces de proporcionar información acerca de:

Hoy en día se continúa avanzando y cabe citar al científico japonés K. Tanaka, que bombardeando muestras de macromoléculas biológicas en estado sólido o viscoso con rayos láser, consiguió su dispersión en porciones ionizadas de pequeñísimo tamaño, aptas para su análisis por espectrometría de masas. Un método para determinar la masa de macromoléculas en espectrometría es acelerarlas en una cámara de vacío y medir su "tiempo de vuelo". Los blancos del espectrómetro son alcanzados por las moléculas en un orden determinado por sus unidades Thomson. Las más rápidas son las más ligeras y de mayor carga (Rubinson, Rubinson, 2000, pg.291)

Estos métodos poseen muchas aplicaciones como son el desarrollo de productos farmacéuticos, control de sustancias nutritivas y diagnósticos precoces de enfermedades como la malaria, cáncer de mama, cáncer de próstata, etc.

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FUNDAMENTOS TEÓRICO- TÉCNICOS DE E.M.

Hoy en día, esta técnica continúa teniendo los mismos fundamentos que en su origen, aunque el espectrómetro de hoy en día poco tenga que ver con su predecesor.
La espectrometría de masas se fundamenta en la separación de partículas moleculares o atómicas por su diferente masa.
El proceso de la espectrometría de masas comprende básicamente cuatro etapas:

imagenf
Fig.1: Esquematización del paso de una muestra por los principales componentes de un instrumento de espectroscopia de masas.

  1. Ionización de la muestra (Oriol, 1998, 312-313)

La ionización de la muestra se consigue por bombardeo mediante electrones (e-) según el proceso:


M + e- à M+ + 2e-

  1. Aceleración de los iones por un campo eléctrico(Oriol, 1998, 313)

Convertimos una fracción significativa de los átomos formados en la etapa 1 en un flujo de iones, generalmente positivos y de carga única.
La velocidad que adquieren viene regida por la formula:

v = [2eV/m] ½

Donde V es el potencial aplicado, “e” la carga del electrón y “m” la masa.
Cuando las partículas aceleradas se someten a la acción de un campo magnético (H) describen una trayectoria circular de radio r alrededor de este campo, desarrollando una fuerza centrífuga mv2/r, la cual es igual a la fuerza de atracción del campo Hev.
De esto deducimos que el radio es igual a:

r = (2Vm/H2e) ½

  1. Dispersión de los iones según su relación masa/carga (Oriol, 1998, 315)

Basándonos en la ecuación anterior podemos calcular la relación m/e que es:

m/e = H2.r2/2V

Dado que la mayoría de los iones formados en la segunda etapa tienen una sola carga y que el resto de parámetros se mantienen constantes, la relación m/e suele ser la masa del ión.
La utilidad analítica de un espectrómetro de masas depende de la resolución del instrumento, o capacidad del mismo para separar dos partículas de diferente masa.

  1. Detección de los iones y producción de la correspondiente señal eléctrica (Oriol, 1998, 317).

El ordenador al que está conectado el aparato recoge las distintas señales y las reproduce en forma de espectrograma, formato de fácil interpretación.

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INSTRUMENTACIÓN EN E.M.

Básicamente un espectrómetro de masas costa esencialmente de las siguientes partes:

En el sistema de entrada de muestras, un micromol o menos de muestra se convierte al estado gaseoso por calentamiento a unos 400ºC y se introduce lentamente en la cámara de ionización.
La finalidad del sistema de entrada es permitir la introducción de una muestra representativa en la fuente de iones con la mínima perdida de vacío. En los espectrómetros de masas más modernos encontramos diferentes tipos de sistemas de entrada:

Las fuentes de iones de los espectrómetros de masas, tienen todas unas características comunes, pese a la variabilidad de tipos existente y es que todas transforman los componentes de una muestra en iones.
En muchos casos el sistema de entrada y la fuente de iones están combinados en un único componente. En todos los casos, se obtiene un haz de iones positivos o negativos (normalmente positivos) que posteriormente se acelera hacia el interior del analizador de masas o sistema separador a través del acelerador.(Skoog, Hiller, Hieman, 2000, 212).

La formación de iones del analito es el punto de arranque de arranque de un análisis por espectrometría de masas. El aspecto de los espectros de masas para distintas especies moleculares, depende en gran medida del método utilizado para la formación de los iones. Estos métodos los podemos dividir en dos categorías:

Están generalmente restringidas a compuestos térmicamente estables que tengan puntos de ebullición menores de unos 500ºC. En la mayoría de los casos, estos requerimientos limitan la utilización de las fuentes de fase gaseosa a compuestos con pesos moleculares menores de unos 103 Daltons.

Son aplicables a muestras no volátiles y térmicamente inestables (Harvey, 2002, 486) Normalmente los espectrómetros de masas están equipados con accesorios que permiten intercambiar ambos tipos de fuentes.
Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de 1000 Daltons.

• Fuentes de desorción 2: es estas la muestra en estado sólido o líquido, se transforman directamente en iones gaseosos.

Son aplicables a muestras no volátiles y térmicamente inestables (Harvey, 2002, 486) Normalmente los espectrómetros de masas están equipados con accesorios que permiten intercambiar ambos tipos de fuentes.

Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de 100000 Daltons.

Las fuentes de iones se pueden clasificar también en fuentes duras y fuentes blandas.

TIPO

NOMBRE Y ACRÓNIMO

AGENTE IONIZANTE

Impacto de electrones (EI)

electrones energéticos

Fase Gaseosa

Ionización química (CI)

iones gaseosos reactivos

Ionización por campo (FI)

electrodo de elevado potencial

Desorción por campo (FD)

electrodo de elevado potencial

Ionización por electronebulización (ESI)

campo eléctrico elevado

Desorción/ionización asistida por una matriz (MALDI)

haz de láser

Desorción

Desorción por plasma (PD)

fragmentos de fisión del 252Cf

Bombardeo con átomos rápidos (FAB)

haz de átomos energéticos

Espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS)

haz de iones energéticos

Ionización por termonebulización (TS)

elevada temperatura

Fig. 1: Clasificación de los distintos tipos de camaras de ionización, indicando
sus nombres y acrónimos y especificando cada sus agentes ionizantes.

TIPOS DE CAMARAS DE IONIZACIÓN;

Se somete a la muestra a una temperatura suficientemente elevada (normalmente mediante un filamento caliente de wolframio o de renio) como para producir un vapor molecular, el cual posteriormente se ioniza bombardeando las moléculas originadas con un haz de electrones de elevada energía. Pese a sus desventajas, esta técnica es la que se ha usado para determinar la mayoría de los espectros que componen las colecciones de espectros (Rouesac, Rouesac, 2003, 78)

En la ionización química los átomos gaseosos de la muestra (tanto de un sistema de entrada indirecto como de una sonda caliente) se ionizan al colisionar con los iones producidos al bombardear con electrones un exceso de gas reactivo (normalmente metano). Normalmente se utilizan iones negativos, aunque la ionización química de iones negativos se utiliza ocasionalmente en aquellos analitos que contienen átomos muy electrónegativos.

En las fuentes de ionización por campo, los iones se forman bajo la influencia de un campo eléctrico elevado (108 V/cm). Estos campos se producen al aplicar elevados potenciales (10 a 20 kV) a emisores especialmente construidos. Que están formados por numerosas puntas finas cuyos diámetros son menores a 1 µm. A menudo estos emisores adquieren la forma de un fino hilo de wolframio en el cual se han formado dendritas o filamentos microscópicos de carbono por pirólisis 3 de benzonitrilo en un campo eléctrico elevado. El resultado de este tratamiento es la aparición de centenares de microagujas de carbón que emergen desde la superficie del hilo. En este caso el analito adquiere poca energía vibracional y rotacional por lo que tiene poca fragmentación (Rouesaoc, Rouesaoc, 2003, 93-94)

En las dos últimas décadas se han desarrollado numerosos métodos de ionización por deserción para tratar muestras no volátiles o termodinámicamente inestables. Estas técnicas prescinden de la volatilización y de la posterior ionización y en su lugar se suministra energía a la muestra sólida o líquida de diversas maneras, de modo que se provoca la formación directa de iones gaseosos. Como consecuencia se obtienen espectros muy simplificados.

Fuentes de desorción por campo (FD).

Esta fuente de ionización usa un emisor con múltiples puntas, similar al usado en las fuentes de ionización por campo. En este caso el electrodo se coloca sobre una sonda que puede retirarse y recubrirse con una disolución de la muestra, después de reinsertarla la ionización se produce tras proporcionar un potencial elevado a este electrodo. En ocasiones es necesario calentarlo haciéndole pasar una corriente pero puede ocurrir una degradación térmica antes de completarse la degradación.

Desorción/ionización por láser asistida por una matriz (MALDI).

Esta técnica de reciente descubrimiento nos permite calcular pesos moleculares exactos de extractos de biopolímeros polares en un intervalo de masas moleculares de varios cientos de miles de Daltons.
En esta técnica se mezcla una disolución acuoso/alcohólica de la muestra con un exceso de una sustancia matriz que absorbe la radiación. La disolución resultante se evapora en la superficie de una sonda metálica que se utiliza para la introducción de la muestra. La mezcla sólida se expone a la acción de un haz de láser pulsante, provocando la sublimación del analito a iones que son introducidos en un espectrómetro de tiempo de vuelo para el análisis de masas (Creel, Howart, 1993, 336-342).

Ionización por electronebulización (ESI/MS).

Esta técnica se ha convertido en una de las más importantes para el análisis de biomoléculas de pesos superiores a 100.000 Daltons.
Se realiza en condiciones atmosféricas de presión y temperatura. La disolución de la muestra se bombardea a través de una aguja capilar de acero inoxidable a un flujo de algunos microlitros por minuto. Las agujas se mantienen a un potencial de varios kV con respecto al electrodo cilíndrico que rodea a dicha aguja. La niebla de finas gotitas cargadas resultantes pasa a través de un capilar de desolvatación donde se produce la evaporación del disolvente y de las moléculas del analito y donde estas adquieren la carga. Debido a que las gotitas se vuelven más pequeñas por la evaporación del disolvente, su densidad aumenta produciéndose la desorción de los iones en la atmósfera gaseosa.

Fuentes de bombardeo con átomos rápidos (FAB).

Con este tipo de fuentes, las muestras en un estado condensado, a menudo en una matriz de una disolución de glicerol, se ionizan por bombardeo con átomos de xenón o argón de elevada energía. Tanto los iones positivos como negativos del analito son expulsados de la superficie de la muestra por un proceso de desorción.
El haz de átomos rápido se obtiene pasar iones acelerados de argón o xenón de una fuente o cañón de iones a través de una cámara que contiene átomos de argón o xenón a una presión de unos 10-5 torr. Setos experimentan una reacción de intercambio de electrones en resonancia con los átomos obteniéndose un haz de átomos de alta energía. (Plascencia, 2003, 13)

Desorción por plasma (PD).

El deterioro del 252Cf produce dos fragmentos de fisión que viajan en direcciones opuestas. Un fragmento golpea la muestra anulando entre 1-10 iones analíticos. El otro fragmento golpea un detector y desencadena la puesta en marcha de la adquisición de datos. Este método es especialmente interesante para moléculas largas de origen biológico.

Espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS).

Un haz de luz ionizado primitivo como 3He+,16O+, o 40Ar+ es acelerado y enfocado hacia la superficie de la muestra y chisporrotea entrando dentro de la fase gas. Aproximadamente el 1% del material chisporroteado entra en forma ionizada, el cual ya puede ser analizado. SIMS tiene la ventaja que puede ser continuamente chisporroteado desde la superficie y determinar las concentraciones analíticas en función de la distancia desde la superficie original (perfil de profundidad)

Ionización por termonebulización (TS).

La ionización por termonebulización se usa para elementos reflectantes. Una muestra es depositada encima de una cinta metálica, que puede ser de Pt o Re y una corriente eléctrica calienta el metal a altas temperaturas. La cinta es revestida de grafito que reduce la desfragmentación.

En el sistema acelerador las partículas ionizadas producidas por el impacto de los electrones son obligados a atravesar una primera ranura aceleradora por una pequeña diferencia de potencial. Entre esta primera y una segunda ranura existe una diferencia de potencial muy elevada que imprime a las partículas su velocidad final. Una tercera ranura actúa como colimador del haz de partículas.

Para la separación de iones con diferente relación m/e se dispone de varios dispositivos. Lo ideal es que el analizador fuera capaz de distinguir entre diferencias muy pequeñas de masa. Además, los analizadores deberían de permitir el paso del número suficiente para producir corrientes iónicas fáciles de medir. Al igual que sucede con los monocromadores 4 ópticos, a los que los analizadores son análogos, estas dos propiedades no son compatibles y se debe de llegar a un equilibrio que esta regido por la resolución del espectrómetro de masa (Skoog D., Holler J., Nieman T., 2000, pág. 412).
Existen diferentes tipos de analizadores de masas:

fotof1
Fig.3:Diagrama esquemático de un analizador de masas de sector
magnético equivalente a los utilizados en espectrometría de masas,
recalcar la ubicación del sector magnético (laminated magnet)

fotof2
Fig.4: Diagrama de un espectrómetro de masa cuadrupolar,
que es uno de los tipos de analizadores de masa más utilizados en
espectrometria de masas dado su bajo precio y robustez.

La parte fundamental de un instrumento de transformada de Fourier es una trampa de iones en la cual los iones circulan en órbitas bien definidas durante largos periodos. Tales cavidades se construyen aprovechando el fenómeno de resonancia iónica ciclotrónica.
La resolución es espectrometría de masas de transformada de Fourier está limitada por la precisión en la medida de la frecuencia más que por las rendijas o las medidas de campo (Plasencia, 2003, 16-17).
Es posible alcanzar una resolución extremadamente elevada (superior a 106) dado que las medidas de frecuencia se pueden realizar con elevada precisión.

fotof3
Fig.5: Diagrama de un analizador de masa de transformada de Fourier
donde podemos ver sus diferentes elementos, reseñar la situación de la
pompa de iones (turbo pump) cuya función se señala arriba
y que es parte fundamental de este instrumento.

Los iones procedentes del sistema acelerador llegan al detector el cual generalmente esta constituido por un cátodo emisor que al recibir el impacto producido por las partículas cargadas emite electrones. Estos electrones son acelerados hacia un dínodo el cual emite varios electrones más al recibir el impacto de cada electrón. Este proceso se repite varias veces hasta obtenerse una cascada de electrones que llega al colector lográndose una corriente fuertemente amplificada, por un procedimiento muy similar al que se utiliza en los tubos fotomultiplicadores. La corriente obtenida puede amplificarse de nuevo por procedimientos electrónicos y se lleva a un sistema registrador.

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Como consecuencia del bombardeo electrónico en la cámara de ionización, las moléculas se rompen en una serie de fragmentos, siempre que una misma molécula se rompa en las mismas condiciones nos dará el mismo tipo y número de fragmentos y constituyen la fragmentación patrón.
Gracias a esto se pueden determinar que es la muestra por comparación y por otra parte, la intensidad relativa de los distintos picos, permite deducir la proporción en que cada componente se encuentra en la muestra.
El pico del espectrograma que aparece con valor más elevado de m/e corresponde a la molécula ionizada sin fragmentar y recibe el nombre de masa patrón. Esta masa patrón nos permite determinar con rapidez y precisión la masa molecular, siempre que se opere con una tensión de ionización no excesivamente elevada, la cual produciría la fragmentación total de la molécula (Rouessac, Rouessac, 2003, 312)
El pico mayor del espectrograma de masa se llama pico base. Normalmente la altura de este pico se toma como valor cien. Las intensidades de los demás picos se expresan en porcentajes de la intensidad del pico base.

fotof4
Fig.6: Aspecto clásico de un espectrograma de masas, en el que se señalan su pico base
y su ión molecular más importante. La tabla situada a la derecha nos indica la concentración
y la relación m/z de cada uno de los elementos presentes en el analito

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Las aplicaciones son tan numerosas y abarcan tantos campos que resulta complicado citarlas todas, a continuación veremos las más características:

Vamos a ver ahora de un modo más extenso las principales aplicaciones de esta técnica.

Para la determinación cuantitativa de los componentes de una mezcla es conveniente que cada uno de ellos presente por lo menos un pico que difiera claramente de los demás. La calibración se realiza por comparación de los picos con patrones adecuados. Las alturas de los picos son directamente proporcionales a las presiones parciales de los componentes volatilizados en la muestra.
Las aplicaciones cuantitativas de la espectrometría de masas para analisis cuantitativo son de dos tipos:

Espero que el estudio realizado sobre la Espectrometría de masas pueda resultar de ayuda a los lectores y les ayude a entender este complejo instrumento y poder aplicarl con una mayor efectividad.

De este trabajo me gustaría destacar la importancia de esta técnica desde sus comienzos hace más de cien años hasta la actualidad donde nos la encontramos como un instrumento altamente especializado y aplicable en multitud de campos.

Resultó indispensable en el conocimiento de la estructura molecular, ayudó a sentar las bases físico-químicas actuales y a derrumbar el modelo atómico de Bohr.
Pese a sus casi cien años de edad continua siendo uno de los instrumentos más recurridos a la hora de analizar todo tipo de muestras ya que de ella se destaca su gran versatilidad, facilidad de uso y fundamentalmente, porque es uno de los pocos instrumentos que te permiten realizar un análisis cualitativo y cuantitativo de forma simultanea y de calidad.
Sus ámbitos de uso se encuentran un tanto restringidos dado su elevado precio, su principal enemigo y retractor, pero que no está impidiendo que cada día se imponga más frente a otras más innovadoras y su demanda no haga más que aumentar.
Vemos que el estudio exhaustivo de este instrumento es fundamental para su óptima utilidad, ya que te permite combinar diferentes tipos de cada uno de sus elementos para adecuarlo a las necesidades de cada investigación.
Hoy en día se continua investigando en nuevas instrumentos de mejora para esta técnica, ya que cada día se exigen resultados con mayor precisión o simplemente porque se analizan muestras en las que se requiere una mayor especialización.
Esta variabilidad ha hecho que continúe vigente y se mantenga altamente adaptada en la actualidad, unido, como no, a su alta aplicabilidad en campos tan variados como la medicina, criminalística, I+D farmacéutica o los laboratorios de biología molecular entre otros.

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APÉNDICES

GLOSARIO

BIOGRAFÍAS.

PROCEDENCIA DE LAS ILUSTRACIONES

Fig.1: Imagén disponible en: http://www.ugr.es/~quio red/espec/ms1.htm

Fig.2: Harvey, 2002, pag.296.

Fig.3: Imagen disponible en: http://www3.imperial.ac.uk/ear thscienceandengineering/research/ggp/icpmsmulticollect or/micromassisoprobe

Fig.4: Imagen disponible en: http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/quad-massspec.html

Fig.5: Imagen disponible en: http://collaboratory.emsl.pnl.gov/projects/AAAS/fticr/sld001.htm

Fig.6: Imagen disponible en: http://www.ugr.es/~quio red/espec/ms1.htm

BIBLIOGRAFÍA

Disponible en: http://www.ugr.es/~quio red/espec/ms1.htm

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1 La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa formada por capilares muy finos.

2 Lo contrario a la adsorción; la eliminación de materia desde un medio adsorbente, usualmente para recuperar material.

3 Descomposición térmica de materiales que contengan carbono en ausencia de oxígeno.

4 Un monocromador es un sistema con un elemento dispersivo (prisma o red de difracción) cuya función es la de separar angularmente las distintas longitudes de onda de un haz de luz policromático

5 Pequeñas sustancias coloidales (nanocoloides) cuyas partículas son neutras y biológicamente inertes, con tamaño alrededor de los 50 nanómetros. Los nanocoloides se marcan con 99mTc, radionúclido que presenta grandes ventajas prácticas como son su alta disponibilidad y su facil detección. Estos preparados son estables in vivo y su mecanismo de acción es físico